【關鍵詞】 羥基磷灰石 二氧化鋯 組織相容性
【摘要】 ［目的］評估奈米羥基磷灰石-二氧化鋯生物陶瓷材料組織相容性。［方法］根據iso10993-1標準，採用細胞毒性試驗、急性毒性試驗、溶血試驗和體內植入(90 d)試驗對奈米羥基磷灰石-二氧化鋯生物陶瓷材料組織相容性進行評估。［結果］奈米羥基磷灰石-二氧化鋯生物陶瓷材料組織相容性的細胞毒性評分小於i級，細胞生長無明顯抑制現象，無急性毒性反應，無溶血反應，體內植入符合植入材料生物學評價要求。［結論］奈米羥基磷灰石-二氧化鋯生物陶瓷材料具有良好的組織相容性，作為骨組織工程中生物支架材料具有廣闊臨床應用前景。
【關鍵詞】 羥基磷灰石 二氧化鋯 組織相容性
histocompatibility evaluation of nano hydroxyapatite-40% zirconia composite bioceramic
li chao,tao shu-qing,zhou chang-lin,et al.
department of orthopaedics,the second affiliated hospital of harbin medical university,harbin 150086, china
abstract: ［objective］to evaluate the histocompatibility of nano hydroxyapatite-zirconia composite bioceramic. ［methods］according to the standard of iso 10993-1,cytotoxicity experiment,acute toxicity test,hemolysis test and in vivo implantation(90 days) test were conducted to evaluate the histocompatibility of nano hydroxyapatite-zirconia composite bioceramic.［results］the score of cytotoxicity experiment was lower than grade i,and there was no significant inhibition of cell growth,no acute toxic reaction or hemolytic the in vivo implantation met the requirements of the biological evaluation of implant materials.［conclusion］nano hydroxyzpatie-zirconia composite bioceramic showed a good has a broad prospect as a biomaterial scaffold in the bone tissue engineering.
key words：hydroxyapatite; zirconia; histocompatibility
生物陶瓷是目前骨組織工程常用的支架材料，傳統的生物陶瓷材料由於粒徑較大，氣孔大，其脆性及彈性模量較大，影響了在生物醫學領域的應用［1］。由哈爾濱工業大學材料學院與哈爾濱醫科大學附屬第二醫院骨外科共同研究製備的奈米羥基磷灰石-40%二氧化鋯(nano hydroxyapatite-40%zirconia，nano ha-40%zro2)陶瓷材料強度、硬度、韌性和超塑性上都得到提高，如在人工器官制造，臨床應用等方面將比傳統陶瓷有更廣泛的應用並具有極大的發展前景。本研究選用細胞毒性試驗、急性毒性試驗、溶血試驗，植入實驗評價奈米ha-40%zro2組織相容性，初步評價該材料應用於臨床醫學的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料的製備與浸提液提取
ha／40%zro2、ha由哈爾濱工業大學材料學院與哈爾濱醫科大學附屬第二醫院骨外科共同研究製備，用溶膠-凝膠(sol-gel)法制成奈米羥墓磷灰石粉粒(ha)［2］，然後將質量比按60%奈米ha+40%二氧化鋯比例配製，奈米ha和二氧化鋯粉體經充分研磨後得到奈米羥基磷灰石／二氧化鋯複合粉體，採用熱壓低溫燒結技術磨削製成3 mm×3 mm×5 mm長方體。將經過環氧乙烷滅菌的上述複合材料以1 g材料／5 ml介質的比例，放入生理鹽水或小牛血中，37℃恆溫箱中靜置浸提72 h製備成ha／40%zro2浸提液，過濾除菌，4℃冰箱儲存備用。
1.2 細胞毒性試驗
1.2.1 實驗方法
採用l929細胞(哈爾濱醫科大學遺傳實驗室饋贈)經復甦、傳代後，將細胞培養基配製1×104個／ml細胞懸液分注於96孔塑料培養皿中，每孔100 μl，每組每觀察期至少8孔，細胞培養箱內培養24 h。然後棄去原培養基，用pbs洗滌2次，試驗組加入100 μl小牛血清浸提液，陰性對照組加入100 μl小牛血清，陽性對照組加入64 g/l苯酚溶液，繼續培養1、2 d和3 d。棄去培養皿中的浸提液和培養基，加入20 μl/孔的mtt液，繼續培養6 h，吸去原液，加入150 μl／孔二甲亞碸，振盪10 min，在beckman du640紫外分光光度計以500 nm波長測定吸光度od值，並計算細胞的相對增殖度(rgr)。rgr=(試驗組od值-空白od值)／(陰性對照組od值-空白od值)
1.2.2 細胞毒性分級與判定
rgr≥100%評為0級；rgr在75%～99%之間評為i級；rgr在50%～74%之間評為ii級；rgr在25%～49%之間評為ⅲ級；rgr在1%～24%之間評為ⅳ級；rgr為0時評為v級)。實驗結果為1或0級反應為合格，實驗結果為ⅱ級反應時需結合細胞形態綜合評價，實驗結果為ⅲ～v級反應為不合格。
1.3 急性全身毒性試驗
1.3.1 動物分組及實驗方法
將20只昆明小鼠(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物實驗中心提供)，雌雄各半，體重（20±2.0） g，隨機均分為實驗組和對照組，實驗組用生理鹽水ha／40%zro2材料浸提液，對照組用生理鹽水，均以50 ml／kg劑量通過小鼠腹腔注射，觀察注射後24、48和72 h動物的一般狀態、毒性表現。
1.3.2 結果評定
72 h內實驗組反應小於對照組為符合要求；實驗組中40%死亡，或60%出現明顯毒性反應，或動物普遍出現進行性體重下降為不符合要求。
1.4 溶血試驗
1.4.1 製備新鮮稀釋血
經肘前靜脈抽取健康人(8人，男性)靜脈血4 ml，混入3.2%檸檬酸鈉緩衝劑0.4 ml，加入生理鹽水5 ml進行稀釋即製備出新鮮稀釋血。
1.4.2 實驗分組及方法
實驗組取ha／40%zro2浸提液10 ml，陰性對照組取9 g/l生理鹽水10 ml，陽性對照組取蒸餾水10 ml，每組各取8個試管，將所有試管放入37℃恆溫箱中水浴30 min，各試管內分別加入新鮮稀釋血0.2 ml輕搖，37℃恆溫保留60 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液在紫外分光光度儀上測定545 nm處的光吸收度(a)。溶血率計算公式：溶血率=(實驗組吸光度-陰性對照組吸光度)／(陽性對照組吸光度-陰性對照組吸光度)×100%
1.4.3 結果評定
溶血率<5%為合格；溶血率≥5%為不合格
1.5 肌肉內種植實驗
1.5.1 實驗分組及方法
選用wister大鼠40只(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物實驗中心提供)，雌雄各半，體重（220±25） g，隨機分為術後第7、15、30、90 d 4組，每組10只。將ha-40%zro2材料塊環氧乙烷消毒後備用。常規麻醉消毒，在大鼠脊柱右側1.0 cm處做切口，分離豎脊肌，於肌肉內植入ha／40%zro2材料塊，縫合肌膜和面板。術後每日予以青黴素20萬u肌注，連續3 d，於術後第7、15、30、90 d取材。
1.5.2 觀察指標
大體觀察：觀察術後大鼠飲食、活動、切口反應；肉眼下觀察有無材料外露，材料表面的包膜形成情況、有無紅腫等。病理學觀察：術後各時相點連同材料、包膜和樣品周圍0.5～1.0 cm厚的肌肉共同取出，常規he染色，每個標本取3張切片。在光學顯微鏡下觀察材料周圍包膜形成情況和組織反應情況。
1.6 統計學處理
應用spss 11.0統計軟體對實驗資料進行統計分析，計量資料兩組間均數比較採用t檢驗，多組間均數比較採用單因素方差分析。
2 結果
2.1 細胞毒性試驗
ha／40%zro2試驗組及陰性對照組，隨著培養時間延長，od值均有增加，陽性組od值無增加，空白組od值為0.041。實驗組與陰性對照組同一時間組間比較差異無顯著性(p>0.05)，與陽性對照組比較差異有顯著性(p<0.01)。ha／40%zro2小牛血清浸提液對l929細胞的細胞毒性均為1級(表1)，符合國家醫用生物材料細胞毒性要求［2］。
2.2 急性全身毒性實驗
實驗小鼠均無死亡、進食正常，無驚厥、呼吸抑制、腹瀉、運動減少和體重下降等不良反應，評價屬無毒級。組間小鼠體重增加量比較差異無顯著性(p>0.05)，小鼠體重增加量見表2。表1 細胞毒性實驗各組od值，rgr和細胞毒性分級分組培養24 hod值rgr（略）
2.3 溶血實驗
ha／40%zro2浸提液組吸光度為0.040±0.003，陰性對照組吸光度為0.009±0.001，陽性對照組吸光度為0.988±0.031，根據溶血率公式計算ha-40%zro2材料浸提液的溶血率為3.17%，溶血率<5%，符合溶血實驗要求。
2.4 肌肉內植入實驗
2.4.1 大體觀察
各組實驗動物術後當天開始進食且活動正常，創口無明顯出血、滲出，術後5 d創口癒合良好。未見面板破潰、植入物外露等現象。將包繞ha-40%zro2材料的組織切開，術後第7、15 d時無明顯包膜形成，第30、90 d時可見包膜組織，包膜隨時間延長逐漸變薄。表2 急性全身毒性實驗體重變化情況（略）
2.4.2 組織病理學檢查
材料植入大鼠豎脊肌植入後7 d，試樣周圍可見以嗜中性粒細胞浸潤為主的炎性反應，可見吞噬細胞，無囊壁形成（圖1）；植入15 d後試樣周圍有少量嗜中性粒細胞、淋巴細胞浸潤和鉅細胞；試樣周圍可見小血管與纖維母細胞增生，開始形成疏鬆囊壁（圖2）；植入30 d後，試樣周圍可見少量淋巴細胞，試樣周圍可見纖維母細胞與膠原纖維，並已形成纖維囊腔結構（圖3）；植入90 d後試樣周圍未見或僅見極少量淋巴細胞，纖維化囊壁緻密，壁的厚度比形成初期要薄（圖4）。
3 討論
生物陶瓷是目前骨組織工程常用的支架材料，常用的是以羥基磷灰石(hydroxyapatite，ha)粉料為原料［2］，經高溫燒結即得到的生物羥基磷灰石陶瓷，由於其粒徑較大，氣孔大，其脆性及彈性模量較大，影響了在生物醫學領域的應用［3］。奈米生物複合材料是將奈米微粒與其他材料複合製成各種複合材料從而獲得許多優良特徵［4］。氧化鋯(zro2)具有良好的耐磨性、抗生理腐蝕性和好的生物相容性，而且其強度、斷裂韌性指標也高於其他所有的生物陶瓷材料，作為第二相顆粒加入到ha塗層中可以顯著提高塗層材料的力學效能 ［5］。目前國內外已製備出含有(10%～70%)zro2的奈米羥基磷灰石複合材料［6］，其強度和韌性等綜合性能可達到甚至超過緻密骨骼的相應效能［7、8］。其zro2含量越高其力學效能提高越明顯，但由於金屬離子效應，吸附在材料表面的組織生物分子的化學組成將會發生相應的變化。為探索在力學效能和組織相容性上達到平衡，由哈爾濱工業大學材料學院與哈爾濱醫科大學附屬第二醫院骨外科共同研究製備成ha／40%zro2，其在強度、硬度和韌性上都得到顯著提高。
當生物材料植入人體後，材料周圍組織(組織細胞，水，離子和生物分子及其他物質的體液)的組成是非常複雜的，表現的形式也多種多樣。組織相容性是指材料與活體組織之間相互容納的程度，即材料的植入或接觸對組織的組成，形態結構和功能的影響［9］。目前，人們對生物材料與骨的相容性研究主要包括三部分：(1)用體外細胞培養法研究其細胞相容性；(2)用體內種植實驗研究其組織相容性；(3)臨床研究其組織相容性。
本實驗測定hap2zro2複合陶瓷的生物學效能首先採用體外細胞毒性實驗，選用的四唑鹽(mmt)法是一種國際標準檢測細胞存活和生長的方法，其原理是活細胞粒線體中的琥珀酸脫氫酶能使外源的`mtt還原為難溶性的藍紫色結晶物(formazan)並沉積在活細胞中，而死亡細胞對mtt不起作用，因此死亡細胞不會被染色。由於mtt結晶物形成量與細胞數呈正比，od值就能間接反映活細胞數量。通過計算出不同濃度試驗材料浸提液作用下的細胞增殖度，可以對該材料的細胞毒性作用作出可靠的定量評價。結果顯示24 h、48 h後的各組ha／40%zro浸提液細胞毒性分級均為0級，72 h後的各組ha／40%zro2浸提液細胞毒性分級0或1級別，且與陰性對照組相比無明顯差異，由此說明ha／40%zro2無細胞毒性作用。
體內植入試驗可從巨集觀和微觀水平來評價組織工程支架材料對組織的區域性反應，包括早期的炎症反應和隨後的纖維增生反應。通過體內植入試驗結果可見，材料在大鼠肌肉內埋植後，均未出現任何壞死、纖維化、異位骨化和囊性改變。鏡下可見在早期(7 d)出現以嗜中性粒細胞浸潤為主的急性非特異性炎症反應，多由於手術創傷、繼發性微生物侵入引起的細菌性炎症或者植入物抑制區域性的免疫應答能力而產生急性炎症反應。植入15 d後，材料周圍嗜中性粒細胞減少，可見淋巴細胞、鉅細胞，轉入慢性無菌性炎症表現，並可見纖維母細胞與膠原纖維，開始形成疏鬆囊壁。植入30 d後，炎症反應明顯減輕並伴有纖維增生反應，植入90 d後，炎症反應基本消失，纖維化囊壁緻密且較初期薄。說明材料對正常組織已無刺激作用。符合植入物正常病理變化及評定標準［10］，說明ha／40%zro2與周圍組織有良好的相容性。
在臨床方面研究其組織相容性，採用的全身急性毒性試驗和溶血試驗，根據結果提示由於ha和zro2為惰性材料，其在生物體內化學性質穩定，無組成元素溶出，因此不會因材料可溶性殘餘分子的化學作用導致生物體急性反應及溶血作用，說明ha／40%zro2無全身急性毒性及溶血反應。
本實驗表明奈米羥基磷灰石-40%二氧化鋯生物陶瓷材料具有良好的組織相容性，考慮到其力學性質的優越性，其作為骨組織工程增韌材料、關節和口腔修復材料具有廣闊的臨床應用前景。在臨床應用之前，該奈米生物材料還需進一步研究遺傳毒性及長期植入試驗，觀察長期植入生物體內後複合材料的化學、力學穩定性及材料微小顆粒溶解情況，為臨床應用奠定基礎。
【參考文獻】
［1］gonzalez p, serra j,liste s,et biomorphic sic ceramics coated with bioactive glass for biomedical application［j］aterials，2003，26:4827-4832.
［2］丁金勇，靳安民.生物支架材料在骨組織工程中的研究進展［j］.中國矯形外科雜誌，2006，1：56-58.
［3］唐佩福，姚琦，黃鵬.碳酸化羥基磷灰石骨水泥的開發與多孔化研究［j］.中國矯形外科雜誌，2008，2：124-126.
［4］sellinger a, weiss pm, brinker cj,et inuous self-assembly of organic-inorganic nanocomposite coatings that minic nacre［j］re, 1998,394:256-259.
［5］肖秀峰，劉榕芳，鄭煬曾.羥基磷灰石／氧化鋯複合塗層熱穩定性和結合強度的研究［j］.無機化學學報，2005，7：965-970.
［6］王竹菊，韓文波，陶樹青.奈米生物陶瓷材料面對骨科應用中強度和韌性的挑戰［j］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，1：160-163.
［7］kim tk, kim ay, choi bi. hepatocaelluar carcinoma:harmonic ultrasound and contrast agent［j］m imaging, 2002,2:129-138.
［8］nayak y,rana rp, pratihar sk,et sureless sintering of dense hydroxyapatite-zirconia composites［j］. mater sci mater med, 2008,6:2437-2444.
［9］周長忍.生物材料學［m］.北京：中國醫藥科技出版社，2004，125.
［10］裴國獻，魏寬海，金丹.組織工程學實驗技術［m］.北京：人民軍醫出版社，2006，182.