在製備凍乾粉針劑的過程中，為了保護藥品的活性，獲得均勻、一致、表面光滑、穩定的產品，必須加入起到填充、賦形、穩定作用的保護劑，很多糖類或多元醇經常被用於溶液凍融和凍幹過程中的穩定劑。常用的保護劑有糖類(如葡萄糖、乳糖等)、多元醇(如甘露醇、山梨醇等)、氨基酸類(如甘氨酸、穀氨酸等)、無機鹽類(如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等)和大分子類(如明膠等)。它們既是有效的低溫保護劑，又是很好的凍幹保護劑，它們對凍結的影響取決於種類和濃度。但在實際應用中，因沒有依據而廣泛嘗試大量保護劑種類，並通過大量實驗摸索確定保護劑品種的凍幹引數是對資源、時間的浪費。本實驗以利巴韋林為模型藥物，同時輔以空白組作為對比，研究蔗糖、無水乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、氯化鉀、甘氨酸7 種不同型別常用凍幹保護劑的預凍時間、用量、凍干時間等凍幹引數，並比較其凍幹後的外觀和復溶效果、含水量、pH 值、主藥含量變化等相關效能，以期對凍幹劑製備時保護劑的選擇提供依據。
1 材料
BX51TRF 型顯微鏡(奧林巴斯株式會社);BSl10S 型萬分之一電子分析天平、P8-10 型pH 酸度計(北京賽多利斯儀器系統有限公司);DW-86L626 型超低溫儲存箱(青島海爾特種電器有限公司);LGJ-12 型冷凍乾燥機(北京鬆源華興科技發展有限公司);FD-1C-50 冷凍乾燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司);Lyo-0.4 型真空冷凍乾燥機(上海東富龍科技有限公司);HCT 型微機差熱天平(北京恆久科學儀器廠);Waters 超高效液相色譜儀：二元溶劑管理系統、線上脫氣機、自動進樣器、PDA檢測器(美國Waters 公司)。利巴韋林由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。Emprove 低內毒素蔗糖(批號K43921892)、Emprove 低內毒素甘露醇(批號M759903247)、Emprove 低內毒素甘氨酸(批號VP559490329)、Emprove 低內毒素山梨醇(批號M630297337)、Emprove 低內毒素氯化鉀(批號A0519420 )、Emprove 低內毒素葡萄糖(批號K45447546413)均由默克化工技術(上海)有限公司提供;無水乳糖(上海昌為醫藥輔料技術有限公司，批號1320012820)。
2 方法與結果
2.1 凍乾粉針的製備
2.1.1 利巴韋林凍乾粉針的製備按照處方量精密稱取利巴韋林250 mg 以及適量凍幹保護劑，用注射用水溶解，定容至10 mL，以0.45μm 微孔濾膜濾過，分裝於5 mL 西林瓶，1 mL/瓶，25 mg/mL。80℃低溫預凍後放入凍幹機中乾燥。
2.1.2 空白凍乾粉針的製備按照處方量精密稱取適量凍幹保護劑，用注射用水溶解，定容至10 mL，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，分裝於5 mL 西林瓶，1mL/瓶，25 mg/mL。80 ℃低溫預凍後放入凍幹機中乾燥。
2.1.3 凍乾粉針的外觀和復溶效果取利巴韋林凍乾粉針和空白凍乾粉針，凍幹保護劑用量為10%，預凍15 h，凍幹15 h，初步比較不同凍幹保護劑的凍幹效果。Emprove 低內毒素葡萄糖、山梨醇凍幹失敗，原輔料損失;Emprove 低內毒素蔗糖和無水乳糖凍幹後外觀和復溶均良好，但放置後逐漸塌陷;Emprove 低內毒素甘露醇、甘氨酸、氯化鉀凍乾粉針的外觀飽滿平整、復溶迅速完全。
2.2 預凍時間的`考察
取利巴韋林凍乾粉針和空白凍乾粉針，凍幹保護劑用量為10%，凍幹15 h，考察不同凍幹保護劑的適用的最短預凍時間。鑑於2.1.3 的結果，凍幹失敗的原因有可能與預凍不完全有關，故不同的凍幹保護劑選擇了不同的預凍時間水平進行考察。依據降低能耗、節約能源的原則，在取得同樣效果的前提下，選擇預凍時間Emprove 低內毒素蔗糖24 h，無水乳糖、Emprove 低內毒素甘露醇、Emprove 低內毒素甘氨酸和Emprove 低內毒素氯化鉀均為9 h，Emprove 低內毒素葡萄糖、山梨醇仍然失敗。
2.3 凍幹保護劑用量的考察取利巴韋林凍乾粉針和空白凍乾粉針，按照2.2的結果確定不同凍幹保護劑的預凍時間，凍幹15 h，考察不同凍幹保護劑、不同用量水平適用的最少用量。依據降低能耗、節約能源的原則，在取得同樣效果的前提下，選擇Emprove 低內毒素蔗糖10%，Emprove 低內毒素甘露醇、甘氨酸、氯化鉀和無水乳糖均為4%，Emprove 低內毒素葡萄糖、山梨醇仍然失敗。
2.4 凍干時間的考察取利巴韋林凍乾粉針和空白凍乾粉針，按照2.2的結果確定不同凍幹保護劑的預凍時間，按照2.3的結果確定不同凍幹保護劑的用量，考察不同凍幹保護劑的適用的最短凍干時間。依據節約輔料的原則，在取得同樣效果的前提下，選擇Emprove 低內毒素蔗糖15 h，Emprove 低內毒素甘露醇、甘氨酸、氯化鉀和無水乳糖均為6 h，Emprove低內毒素葡萄糖、山梨醇仍然失敗。
2.5 驗證試驗
依據單因素試驗結果，確定最優條件，進行 3次驗證實驗，結果見表5。所得凍乾粉針除Emprove低內毒素甘氨酸表面略有裂隙外，其他凍乾粉針均外觀飽滿、平整，同時所有凍乾粉針劑均能夠迅速、完全復溶。
2.6 含水量的測定
採用庫侖法測定含水量。取適量樣品，減重法稱量，加入C30 庫侖法卡爾費休水分儀中，輸入樣品編號和質量後進行測定，最終含水量均為3 批樣品含水量的平均值，結果見表 6，均符合凍乾製劑含水量低於5%的要求。
2.7 pH 值的測定
取凍幹前的樣品溶液 2 mL，將pH 計探頭插入溶液中，直到pH 計讀數不變，此時的讀數即為所求pH 值;凍幹後的樣品以凍幹前相同體積的水復溶後，取2 mL 用pH 計測定pH 值。取實驗所得樣品測定凍幹前後的pH 值，最終pH 值均為3 批樣品的平均值，結果見表7。凍幹後pH 值變化不大，考慮到pH 計存在一定的測量誤差，總體認為pH 值沒有根本性改變，影響不大。
2.8 利巴韋林凍乾粉針中利巴韋林的測定
2.8.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC HSST3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);流動相為純水;體積流量0.25 mL/min;柱溫30 ℃;樣品室溫度4 ℃;檢測波長206 nm;進樣量1 μL。
2.8.2 對照品溶液的製備精密稱定利巴韋林對照品4.01 mg，置10 mL 量瓶中，純水溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.8.3 供試品溶液的製備取空白凍乾粉針劑和利巴韋林凍乾粉針劑各1 瓶，分別用純水溶解，並各自轉移至10 mL 量瓶中，純水稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.8.4 專屬性試驗分別取空白凍乾粉、利巴韋林凍乾粉和利巴韋林對照品溶液，進樣測定，並記錄色譜圖。
2.8.5 標準曲線的建立精密稱定利巴韋林對照品10.03 mg，置25 mL 量瓶中，純水溶解並稀釋至刻度，搖勻即得0.40 mg/mL 利巴韋林對照品儲備液。分別精密移取上述儲備液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL 置10 mL 量瓶中，純水稀釋至刻度，搖勻即得質量濃度分別為12、24、36、48、60、72 μg/mL對照品溶液。將上述對照品溶液進樣分析，並記錄色譜圖。以峰面積對質量濃度進行線性迴歸，得迴歸方程Y=2 591.8 X-1 974.1，R2=0.999 7，表明利巴韋林在12～72 μg/mL 與峰面積線性關係良好。
2.8.6 精密度試驗取利巴韋林凍乾粉針劑1 瓶，製備供試品溶液，連續進樣測定6 次，結果利巴韋林峰面積的RSD 值為1.7%。
2.8.7 重複性試驗取同一批利巴韋林凍乾粉針劑6 瓶，製備供試品溶液，進樣測定，結果利巴韋林質量分數的RSD 值為2.1%。
2.8.8 穩定性試驗吸取利巴韋林凍乾粉針劑供試品溶液，分別於0、2、4、6、8、10、12 h 進樣測定，計算得利巴韋林峰面積的RSD 值為2.2%。結果表明供試品溶液在12 h 內穩定性較好。
2.8.9 加樣回收試驗取已知量的利巴韋林凍乾粉針劑供試品共9 份，精密加入一定量利巴韋林對照品溶液，製備供試品溶液6 份，進樣測定。結果利巴韋林的平均回收率為101.1%，RSD 值為1.7%。
2.8.10 樣品測定取利巴韋林凍乾粉針劑樣品，製備供試品溶液，進樣測定，外標法計算樣品凍幹前和凍幹後利巴韋林的質量分數。
3 討論
實驗選擇了 7 種凍幹保護劑進行比較研究，其中Emprove 低內毒素葡萄糖和Emprove 低內毒素山梨醇在不同因素水平下均未能成功製備粉針劑。Emprove 低內毒素蔗糖、無水乳糖、Emprove 低內毒素氯化鉀、Emprove 低內毒素甘露醇、Emprove低內毒素甘氨酸均能在適宜條件下製備粉針劑。從節約能耗的角度考慮，Emprove 低內毒素甘露醇、Emprove 低內毒素甘氨酸、Emprove 低內毒素氯化鉀、無水乳糖4 種保護劑更為適合選擇，尤以Emprove 低內毒素甘露醇為佳。實驗研究了Emprove 低內毒素蔗糖、無水乳糖、Emprove 低內毒素葡萄糖、Emprove 低內毒素甘露醇、Emprove 低內毒素山梨醇、Emprove 低內毒素氯化鉀、Emprove 低內毒素甘氨酸7 種不同型別常用凍幹保護劑作為水溶性藥物利巴韋林凍幹保護劑的效能，確定了一些基本引數，為水溶性藥物凍乾粉針劑的製備提供了參考。