論文題目：TGF-β1對白血病細胞的作用研究及其機制初探
一、立題依據
轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF- β)是一種多功能細胞因子，因其能使正常成纖維細胞的表型發生轉化而得名。它有五種異構體：TGF-β1 TGF-β2、TGF-β3、 TGF-β4、 TGF-β5，其中TGF-β1作用最強，目前的研究也主要針對TGF-β1。TGF-β1是迄今為止瞭解的功能最複雜的細胞因子之一，是一種具有多種生物學功能的生長因子,目前已知的功能主要有調節細胞生長和分化，誘導細胞凋亡,影響細胞粘連和細胞遷移，促進細胞外基質的形成,調節胚胎髮育過程,促進創傷癒合，參與對免疫抑制以及炎症反應的調節等，TGF-β1還是促進肝臟纖維化的重要細胞因子。TGF-β1 對不同的靶細胞也表現出不同的生物學活性，TGF -β受體廣泛表達於機體組織細胞,由於體內大部分的正常細胞均表達TGF -β家族成員的膜結合受體, TGF-β1與其受體具有高度特異的親和力,因此, TGF-β1對許多細胞都發揮調節作用;生長抑制是TGF-β1特有的性質, TGF-β1對大多數細胞的增值具有抑制作用,尤其是上皮細胞、內皮細胞、淋巴樣細胞或造血細胞。
TGF-β1與腫瘤的發生、發展密切相關,在腫瘤發生早期, TGF-β1 作為腫瘤抑制因子起作用, TGF-β1對正常細胞及早期腫瘤的抑制作用是通過調控細胞週期,抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡來實現的，通過抑制細胞生長週期從G1 →S 期抑制正常細胞生長和腫瘤細胞發生。在G1 期早期, TGF-β1誘導的抑制訊號作用於原癌基因c-myc ,抑制腫瘤的形成; 在G1期晚期, TGF-β1通過抑制細胞週期蛋白(cyclins) , 通過增加週期迴圈蛋白依賴性激酶(CDKs)的抑制性蛋白p15 、p21 、p27 的生成,抑制CDKs的活性,使細胞停止在G1 期或延長G1 期,進而抑制細胞增殖, 誘導細胞分化或凋亡 。如果TGF-β1訊號通路中多種基因突變導致細胞對TGF-β1耐受而使衰老和凋亡通路失活,則可能發生細胞癌變。c-myc蛋白是細胞增殖的重要的調節因子,表達c-myc的細胞能迅速通過G1 期進入S 期,而 TGF-β1可迅速下調c-myc 的mRNA 及蛋白水平。 近年來,圍繞TGF-β1誘導凋亡的分子機制進行了大量的基礎研究。研究表明:在許多型別細胞中, TGF-β1家族成員不僅能抑制細胞增殖且誘導細胞凋亡,由Smad 轉錄複合物控制的前凋亡基因在TGF-β1誘導細胞凋亡的過程中起重要作用。 在造血細胞中, TGF-β1誘導的凋亡依賴於依賴Smad 的SHIP 表達的上調並通過生存蛋白激酶AKT抑制訊號系統。
TGF-β1作為一種重要的腫瘤抑制因子,在血液系統疾病的發生中起重要作用，我們已在這方面開展了若干研究中。我們前期研究中曾用ELISA法檢測急性白血病患者血清及急性白血病原代細胞和細胞株培養上清TGF-β1 水平變化，研究發現急性白血病患者血清中TGF-β1水平明顯減低，經治療獲緩解後其水平恢復正常，復發患者TGF-β1水平又降低，急性白血病原代細胞和細胞株培養上清TGF-β1水平與正常細胞相比有明顯下降。應用 RT-PCR 方法檢測正常巨核細胞、血小板、外周血有核細胞及8種細胞株包括有HEL、K562 、HL60 、U937 、DAMI、MEG-01 、HUT78、CA的TGF-β1 mRNA，結果顯示這些細胞均能表達TGF-β1，這說明在白血病患者血清及急性白血病原代細胞和細胞株培養上清中TGF-β1的低水平很可能與TGF-β1自身產生過程下游蛋白的生成、包裝、分泌受破壞有關，這也提示TGF-β1的低表達可能在急性白血病發病機制中起重要作用。
TGF-β1對紅系、粒系、巨核系晚期祖細胞的分化均具有刺激作用，TGF-β1還有誘導粒系、淋巴系白血病細胞的凋亡作用，我們的研究發現全反式維甲酸誘導HL-60細胞分化成熟的過程中，內源性TGF-β1 mRNA表達上調，我們的研究也發現加入外源性豬全長TGF-β1基因可抑制白血病細胞增殖，誘導白血病細胞凋亡;另一實驗中，將DAMI細胞與TGF-β1孵育48小時後不僅其生長增殖受抑且有呈現細胞凋亡;而在用 AS2O3誘導 HL-60 細胞凋亡的過程中TGF-β1 表達水平增高，bcl-2 基因表達減弱，在此過程中，細胞分泌TGF-β1水平有明顯增高，加入TGF-β1反義ODNS 能夠部分抑制 AS2O3誘導的細胞凋亡，bcl-2 基因表達有所恢復，提示在AS2O3誘導的 HL-60細胞凋亡過程中內源性 TGF-β1 起著重要作用，可能是促進血細胞凋亡的內在動力之一。 同時我們還利用真核表達載體將外源性野生型p53基因(wt-p53)匯入無p53蛋白表達的 HL-60、K562 細胞中，在 wt-p53 基因誘導 HL-60、K562 細胞凋亡早期內源性 TGF-β1mRNA 表達上調，且細胞分泌 TGF-β1 的水平有明顯提高，TGFβ1 的反義 ODNS 能夠部分抑制 wt-p53 誘導的細胞凋亡,使 wt-p53 所致的 K562 細胞 bcl-2 表達陽性率恢復到未經 wt-p53 處理前的`水平，提示 wt-p53 基因在誘導白血病凋亡過程中內源性TGF-β1發揮一定作用，內源性 TGF-β1與 bcl-2 表達之間存在密切關係。
由於TGF-β1有如此複雜的功能，對不同的靶細胞也表現出不同的生物學活性，我們設想通過外源誘導物準確定量調控TGF-β1表達，若能調控成功必將能為我們下一步研究TGF-β1與腫瘤關係提供更多幫助。
迄今為止，己發展多種可誘導基因表達系統，但各自都有侷限性，多數可誘導基因表達以重金屬離子和激素作為誘導劑，誘導表達水平難以準確調控，誘導刺激可引發多種效應，且在誘導劑存在時，時常出現表達滲漏的現象，這些不足限制這些可誘導基因表達系統的應用;而基於LiAC阻遏因子的IPTG誘導表達系統中，儘管其作用較為特異，但誘導過程緩慢，誘導效率低，且誘導劑量接近細胞毒水平，目前應用最為廣泛的是四環素調控基因表達系統(Tetracycline-regulated gene expressionsystem)，是由Gossen等人首先建立的。Tet 調控系統主要包括兩部分: 特異啟動子控制下的Tc 依賴的反式作用子(tTA ) 及tTA 依賴的核心微小啟動子(人鉅細胞病毒啟動子PhCMV) 調控下的目的基因，前者是由大腸桿菌的tetR 和人類單純皰疹病毒(HSV ) 的病毒蛋白P16 (V P16) 的C2末端具有轉錄啟用作用的區域構成的融合蛋白, 其中TetR 介導tTA 與TetO 的結合,V P16 則具有轉錄啟用作用; 後者是在PhCMV 的上游插入7 個頭尾相連的TetO 序列, PhCMV 本身啟動轉錄的能力很低, 但tTA 與TetO 結合後即可啟用目的基因高水平地表達, 而Tc可抑制tTA 與TetO 的結合, 從而抑制轉錄，由於Tc的應用阻抑了目的基因的表達, 故將該系統稱為Tet-off 系統。
1995年，Gossen等基於Tet-off系統，通過隨機突變改變四環素阻遏蛋白(TetR )上4個氨基酸，使其分子結構發生變化，建立了Tet-on基因誘導表達系統，該系統受四環素及其衍生物強力黴素作用剛好與Tet-of系統相反，即在沒有四環素及其衍生物強力黴素的情況下，表達水平幾乎為零，而在加入四環素及其衍生物強力黴素後目的基因高效表達。在Tet-off系統裡，如果需關閉外源基因的表達，就需一直維持誘導物的存在，而Tet - on系統為啟用型表達系統，需要外源基因表達時才加誘導物，相比之下，Tet一on系統具有快速啟用基因，誘導動力學受體內Tet的影響相對較小，能更精確的進行目的基因的調控，使用更為方便經濟。所以，Tet - on系統已被成功的應用於哺乳動物細胞培養、轉基因鼠、基因治療研究
T-REx系統是一種用於哺乳動物的四環素調控基因表達系統，其調控元件來自大腸桿菌E. coli Tn10編碼的四環素耐藥操縱子。在該系統中，四環素對目標基因的調控有賴於外源性四環素與質粒中TetR結合，從而使控制目的基因表達的啟動子去阻遏，T-REx系統中最重要的構成成分是可誘導表達質粒---pcDNA4/TO/myc-h i s A, B, C。目的基因在該質粒CMV啟動子的調控下得以表達。該質粒的CMV啟動子中含有兩個四環素操縱子序列( Tet0 )，每個四環素操縱子含有19個核苷酸(5'-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3')序列。兩個四環素操縱子序列被2個礆基對的空間所隔開。每個19個核苷酸序列做為一個TetR同源二聚體的結合位點。T-Rex中新近發展的Tet-off/Tet-on系統是一種高效無毒、具有嚴密開/關功能的基因誘導表達系統，具有嚴密性、特異性、高效性等優點，該系統是目前比較成熟的真核生物基因誘導表達系統之一。
應用T-REx調控系統對匯入外源性TGF-β1基因進行白血病細胞內源性TGF-β1定量表達調控，以及定量調控後對白血病細胞生物學特性影響的研究目前國內外均未見報道，本課題的研究旨在進一步深入探討TGF-β1對白血病的作用及機制。
二、研究目的、意義和應用前景
以白血病細胞HL-60為模型，人全長TGF-β1基因為物件，研究TGF-β1對白血病細胞體外和體內作用的同時，利用四環素調控系統,構建可調控的含人全長TGF-β1基因真核表達載體，用脂質體轉染法將人TGF-β1基因轉染HL-60細胞中，研究TGF-β1基因轉染後HL-60細胞的TGF-β1表達的定量調控，及轉染基因細胞的生物學特性改變，觀察轉染基因細胞的體內致瘤性，進一步探討TGF-β1對白血病的作用及機制。
三、課題設計方案及技術路線
(一)研究TGF-β1對HL-60細胞體內外抗白血病的作用。
(二) pcDNA4- TGF-β1 質粒構建。
通過酶切→去磷酸化→連線→轉化→單克隆菌落培養擴增→大量抽提，構建並提取構建好的pcDNA4- TGF-β1 質粒，經PCR鑑定、酶切電泳鑑定、及最終DNA測序，選出全長TGF-β1片段正向連入pcDNA4/TO的質粒。
(三) pcDAN6/TR質粒轉染HL-60細胞並篩選，單克隆擴大培養。
1、確定Blasticidin 的篩選濃度。
2、脂質體法轉染HL-60細胞，通過Blasticidin篩選，獲得穩定轉染細胞命名TREx- HL-60細胞。
(四)將構建的pcDNA4- TGF-β1 質粒轉染 TREx- HL-60細胞,並篩選，單克隆擴大培養。
1、確定Zeocin的篩選濃度。
2、脂質體法轉染 TREx- HL-60細胞,通過Zeocin篩選，獲得穩定轉染細胞命名HL-60-PTT細胞。
(五) 對HL-60-PTT細胞進行生物學特性研究。
1、用ELISA法 、 Western blot方法測定不同濃度四環素作用下HL-60-PTT細胞的TGF-β1 的表達水平。
2、用定量PCR法測定不同濃度四環素作用下HL-60-PTT細胞的TGF-β1 mRNA.、TGF-β2 mRNA、TGF-β3 mRNA及TGF –βRⅠ、TGF –βRⅡ、hTERT、 Smad3、4、7、c-myc、bcl-2等基因表達的水平的變化。
3、觀察不同濃度四環素作用下HL-60-PTT細胞的增殖情況(分別採用MTT法測定、白血病細胞集落培養法及流式細胞儀檢測法)
4、對HL-60-PTT細胞進行細胞調亡檢測(分別採用片段化DNA分析、TUNNEL及流式細胞儀測定DNA含量方等法檢測。)
5、觀察ATRA誘導HL-60-PTT細胞分化過程中,不同濃度四環素作用下以下指標的變化。
a、細胞分化的檢測：瑞氏染色觀察細胞形態，流式細胞術檢測分化抗原。
b、RT-PCR法檢測不同劑量下ATRA對HL-60-PTT細胞的影響：對TGF-β1 的定量表達與端粒酶活性及hTERT、c-myc和bcl-2等表達影響的研究。
(六) 通過攝入不同濃度四環素進一步研究轉染後HL-60-PTT細胞對裸鼠荷瘤的影響。
觀察腫瘤生長大小、腫瘤細胞調亡情況及對小鼠心、肺、肝、脾、腎等臟器的影響。
四、預實驗結果
成功構建pcDNA4- TGF-β1 質粒，已篩選並擴大培養TREx- HL-60細胞,目前正進一步單克隆轉染細胞HL-60-PTT，通過ELISA法檢測瞬時轉染細胞上清TGF-β1，證實不同濃度四環素能誘匯出不同水平的TGF-β1。(詳見幻燈)
五、統計學方法
結果以資料及圖表表示，測定值以均數±標準差表示，採用SPSS11.0軟體分析，多組間均數比較用單因素方差分析，組間比較用最小顯著差法。
六、課題進展安排
20XX.1-20XX.6 查閱文獻、確定課題
20XX.7-20XX.6 實驗前準備、預實驗
20XX.7-20XX.3 正式實驗
20XX.4-20XX.7 撰寫論文、答辯